Применение он-лайн твердофазной экстракции с помощью модуля Agilent 1290 Flex Cube c последующим ВЭЖХ-МС-МС анализом

Применение он-лайн твердофазной экстракции с помощью модуля Agilent 1290 Flex Cube c последующим ВЭЖХ-МС-МС анализом в химико-токсикологическом анализе образцов мочи в скрининговом анализе наркотических средств. Предложенный способ существенно сокращает время анализа и трудозатраты на пробоподготовку, где потери аналитов сравнимы с другими способами.

В качестве примера пробоподготовки представлен пример использования он-лайн твердофазной экстракции на базе Agilent 1290 Flex Cube в химико-токсикологическом анализе образов мочи подвергшихся минерального гидролизу, с последующим анализом методом ВЭЖХ-МС-МС (qTOF). Применение подобной пробоподготовки значительно сокращает трудозатраты и продолжительность исследования. 

Данный метод был разработан А.В. Лабутиным, Областное государственное учреждение здравоохранения «Томский областной наркологический диспансер». 

Наиболее распространенным объектом в практике химико-токсиколоигчеких лабораторий для такого анализа является моча. С одной стороны именно в моче всегда бывает достаточно высока концентрация ксенобиотиков (к которым относятся в том числе наркотические средства), особенно в период их максимального выведения. С другой стороны моча - относительно простой объект для проведения пробоподготовки, так как содержит небольшое количество высокомолекулярных, а также низкополярных соединений.

Но тем не менее пробоподготовка для образцов, приготовленных из мочи все равно необходима, так как эти объекты в большом количестве содержат минеральные соединения (как естественные соли организма, так и соли образующиеся в ходе нейтрализации минеральных кислот и оснований после гидролиза), большое количество сильно полярных азотсодержащих и кислородсодержащих соединений, таких как сахара и продукты их минеральной деградации, креатинин, мочевина, гиппуровая кислота, аминокислоты и пр. Наличие таких соединений в больших количествах не желательно для ВЭЖХ-мс анализа, так как во первых они перегружают колонку, во вторых загрязняют источник ионизации и могут в значительной мере подавлять ионизацию целевых соединений. Классическим способом пробоподготовки является жидкость-жидкостная либо оф-лайн твердофазная экстракция. Основным недостатком этих методов является их трудоемкость, временные затраты, влияние человеческого фактора на успешное протекание процессов пробоподготовки. Однако в настоящее время стали активно появляться сообщения о успешном использовании методов он-лайн твердофазной экстракции для подобного вида анализа. Применение этого метода позволяет cвести трудозатраты и расход реактивов к минимуму.

Экспериментальная часть. Оборудование

Пробоподготовка

Перед анализом пробы мочи подвергают минеральному гидролизу. Наиболее информативным с точки зрения наличия метаболитов является совместное проведение кислотного и щелочного гидролиза. Для проведения гидролиза две аликвоты мочи каждая по 4 мл вносят в две стеклянные емкости, к одной добавляют 6Н раствор минеральной щелочи (NaOH либо KOH), к другой добавляют 6Н раствор HCl., после чего обе емкости герметично закрывают и нагревают в течении 40минут при 90 0C.

После чего обе емкости остужают до комнатной температуры, и смешивают содержимое.При необходимости доводят рН до значения 8 с помощью буфера.

Полученную смесь гидролизатов далее фильтруют через фильтр с размером пор 0,45мкм и вводят в систему ВЭЖХ-МС, снабженную оборудованием для он-лайн твердофазной экстракции.

Конфигурация системы и принцип работы

Система он-лайн твердофазной экстракции была построена на базе модуля Agilent 1290 flex cube G4227A с использованием одного 10-портового крана и насоса для твердофазной экстракции (Piston Pump). Схема подключения и работы системы он-лайн ТФЭ приведена ниже (рис.1-2). Порядок работы системы представлен в таблице 1.

При загрузке образца в картридж кран находится в положении Position 2, при этом через картридж пропускается сначала проба в количестве 30мкл, затем 2мл промывочного раствора, для удаления основных балластных веществ и минеральных компонентов. Промывочный раствор представляет собой 5% раствор этанола в воде с рН доведенной до значения 8-9, с помощью аммиачно-цитратного буфера. Затем через систему пропускают 0,5мл, Буфера А из системы ВЭЖХ для уравновешивания рН системы. После чего 10-ти портовый кран переключается в положение Position 1 (рис 2) и через картридж ТФЭ пропускается рабочий элюент ВЭЖХ и попадает в колонку. Программа градиента ВЭЖХ приведена в таблице 2.

Таблица 1. Порядок работы системы он-лайн твердофазной экстракции.

   Рисунок 3. Пример програмирования системы flex cube в ПО MassHunter

Условия ВЭЖХ анализа
   

  
МС метод

Детектор Agilent 6540 работал в режиме положительной электрораспылительной ионизации в следующих условиях: температура источника ионов - 350 оС, напряжение на капилляре - 3.5 кВ, напряжение на фрагментаторе - 100 В, напряжение на скиммере - 65 В, расход газа-осушителя 8 л/мин, расход вспомогательного газа 8 л/мин, диапазон сканирования ионов-предшественников - 100-500 Да, диапазон регистрации ионов-продуктов - 50-500 Да.
Газ для соударений - азот, давления газа для соударений в ячейке соударений - 1.37 кПа , энергия соударений 20 эВ. Режим работы детектора - высокое разрешение (40000 на половине высоты при m/z 622, точность измерения масс
0.    08 ррм), скорость сканирования - 5 сканов в сек.

Настройка прибора и автоматическая коррекция точности измерения масс в реальном времени проводилась с использованием стандартных растворов, рекомендованных производителем прибора, состоящих из трифторацетата натрия, пурина и гексакис (2,2,3,3- тетрафторпропокси) фосфазина (HP-0921).

Работа проводилась в режиме «auto-ms», предполагающим автоматический отбор пяти наиболее интенсивных ионов- предшественников, и их последующей фрагментацией, активированной соударениями. При проведении отбора иона предшественника окно пропускания квадрупольного фильтра масс задавалось 1,3 а.е.м.

Реактивы

Использованы следующие реактивы: вода деионизованная (из системы водоподготовки Milli-Q, Millipore, США), ацетонитрил, квалификации «чистый для хроматографии», муравьиная кислота, квалификации "х.ч.”.

Результаты и их обсуждение

Для проверки работоспособности системы готовили контрольные растворы модельных соединений, по свойствам близких к определяемым в обычной практике соединениям. Один раствор представлял собой водный раствор содержащий по 25нг/мл толперизона и димедрола и 50нг/мл индометацина., другой раствор представлял собой холостой образец мочи подвергшийся гидролизу, с добавкой этих же соединений в аналогичных концентрациях, рН раствора доведено до 8. [2]

В ходе исследования анализировали указанный выше водный раствор как с использованием системы он-лайн ТФЭ, так и без нее, используя прямой ввод аналогичного количества вещества непосредственно в аналитическую колонку, после чего анализировали с применением метода он-лайн ТФЭ образец гидролизованной мочи с добавкой указанных соединений. Результаты измерений площадей пиков указанных веществ приведены в таблице 3.

Таким образом видно, что использование системы он¬лайн ТФЭ позволяет использовать ее в качестве части метода пробоподготовки для таких сложных образцов как гидролизаты мочи. Использование данного метода позволяет избавиться от минеральных соединений, вредных для источника ионизации, и кроме того также от большого количества гидрофильных органических соединений, имеющихся в матрице, во время стадии промывки буферным раствором содержащим небольшое количество органического растворителя, в то же время переключение крана модуля ТФЭ сразу после выхода на плато градиента ацетонитрила и последующая промывка картриджа этанолом, позволяет недопустить попадания сильно гидрофобных веществ в колонку и таким образом продляет срок ее службы.

Использование предложенного метода пробоподготовки позволяет провести весь анализ после стадии гидролиза за 15 минут, в то время как применяя традиционные методы пробоподготовки - жидкость-жидкостную и офф-лайн твердофазную эктракцию, только стадия выпаривания растворителя применяемого для экстракции может занимать около получаса. Кроме того, сокращается расход растворителей и контакт оператора с токсичными растворителями. Так единственный растворитель который применяется в методе кроме ацетонитрила - относительно безопасный и дешевый этанол.

Существенным ограничением предложенного метода является невозможность анализировать сравнительно гидрофильные вещества, такие как морфин, кодеин. Амфетамин в ряде случаев также показывает плохие результаты по степени извлечения при анализе указанным методом. Также стоит отметить что перед использованием предложенного варианта прободготовки для анализа конкретных соединений необходимо проверить степень их извлечения в данных условиях, и возможность их анализировать в рабочих объектах на требуемых пределах обнаружения.

Заключение

Предложен способ пробоподготовки основанный на он-лайн твердофазной экстракции реализованной с помощью блока Agilent flexcube 1290, для автоматизации и упрощения процедуры проведения химико¬токсикологического анализа образцов гидролизованной мочи. Предложенный способ существенно сокращает время анализа и трудозатраты на пробоподготовку. Потери аналитов хотя и весьма заметны при использовании данного метода, однако сравнимы с таковыми в случае применения более традиционных способов пробоподготовки, а ряде случаев даже превосходят их. [1]. Кроме того потери аналитов при извлечении компенсируются высокой чувствительностью оборудования, которая дополнительно может быть повышена при использовании других режимов работы масс-селективного детектора.