В представленной работе рассмотрен анализ мочи на наличие метаболитов каннабимиметиков JWH-018 и JWH-073 методом газовой хромато-масс-спектрометрии с кислотной деконъюгацией метаболитов и дериватизацией метилированием. Приведены хромато-масс-спектрометрические характеристики определяемых метаболитов.
Григорьев А.М1,2., Данилюк А.А1,2., Савчук С.А3., Рудаков О.Б1.
1Воронежский государственный архитектурно-строительный университет, 2ГУЗ «Бюро судебно-медицинской экспертизы по Белгородской области», 3Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова
Синтетические каннабимиметики – сравнительно новая группа психоактивных соединений, обнаруженных в конце 2008 г. в составе курительных смесей («спайсы», «Spice») и продуцирующих каннабиноидоподобные эффекты [1]. Впоследствии обнаружение этих соединений, используемых в качестве компонентов в коммерчески доступных продуктах, было подтверждено европейскими и японскими исследователями [2-6]. Одними из первых членов этой группы были нафтоилиндольные производные JWH-018 и JWH-073, распространяемые на полулегальных рынках ряда стран мира, и – в том числе – в России, особенно среди мигрантов, активно привлекаемых в строительной индустрии в качестве дешевой рабочей силы. В настоящее время эти соединения включены в Список наркотических средств и психотропных веществ, оборот которых в Российской Федерации запрещен. Учитывая рекреационный характер употребления курительных смесей, следует ожидать их распространения среди молодежных групп, и – в том числе – среди студентов. Это замечание, а также запрет оборота JWH-018 и JWH-073 требуют проведения наркологического и химико-токсикологического контроля над их употреблением.
Каннабимиметики JWH-018 и JWH-073 подвержены быстрому и интенсивному метаболизму, что делает крайне маловероятной возможность их обнаружения в нативном виде в моче. Кроме того, методы обнаружения идентифицированных к настоящему времени метаболитов слишком дороги или неудобны для большинства специализированных аналитических лабораторий. Методами газовой и жидкостной хромато-масс-спектрометрии мы идентифицировали в моче 5 дезалкилированных метаболитов JWH-073, структурно аналогичных метаболитам JWH-018. Это наблюдение было использовано для разработки дешевого способа определения факта употребления указанных каннабимиметиков без возможности их дифференциации. Анализ образцов мочи основан на применении газовой хромато-масс-спектрометрии с кислотной деконъюгацией метаболитов и дериватизацией метилированием.
Известно, что JWH-018 (1-пентил-1H-индол-3-ил)(нафталин-1-ил)метанон) и его гомолог JWH-073 (1-бутил-1H-индол-3-ил)(нафталин-1-ил)метанон) были синтезированы и охарактеризованы в процессе работ по поиску безопасных фармакологических заменителей ?9-тетраканнабинола (психоактивного компонента конопли) и изучению каннабиноидных рецепторов CB1 and CB2 [7, 8]. Оба соединения продемонстрировали высокую аффинность к рецептору CB1 (константы аффинности Ki = 9 и 8.9 нМ, соответственно), принимающему участие в механизмах формирования боли и эмоционального состояния [7-9]. Продукты, содержащие JWH-018 и JWH-073, запрещены в ряде стран, и в том числе – в России [1]. Описанные в научной литературе симптомы интоксикации, вызванной употреблением синтетических каннабимиметиков, включают тахикардию, возбуждение, галлюцинации и гипертензию [10, 11]. Кроме того, описан, по крайней мере, один случай формирования синдрома зависимости [12].
N-алкилиндольные каннабимиметики, к которым относят JWH-018 и JWH073, подвергжены быстрому и экстенсивному метаболизму фаз I и II [13-24, 27-30], что приводит к отсутствию или очень малому содержанию исходных соединений в моче и, следовательно, затрудняет диагностику интоксикации. Употребление синтетических каннабимиметиков может быть диагностировано по наличию исходных соединений в сыворотке крови [25], хотя их концентрация быстро снижается [26]. Опубликованные сообщения, касающиеся идентификации метаболитов JWH-018 и JWH-073 позволяют заключить, что основными мочевыми метаболитами являются продукты гидроксилирования исходных структур при расположении гидроксильных групп на N-алкильной цепи, а также продукты Nдезалкилирования, совмещенного с гидроксилированием ароматических остатков. Гидроксилированные метаболиты присутствуют в моче в конъюгированном состоянии [13-24, 27-29].
Рассматривая результаты исследований, описывающих обнаружение метаболитов JWH-018 и JWH-073 в моче, можно сделать вывод о том, что наиболее удобным и современным методом является жидкостная тандемная хромато-массспектрометрия (ЖХ-МС/МС) при деконъюгации метаболитов фазы II с помощью ферментов-глюкуронидаз. Однако данный метод дорог и, следовательно, недоступен для большинства российских химико-токсикологических и судебно-химических лабораторий. Более приемлемым для рутинного анализа является применение газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) после кислотной деконъюгации метаболитов и дериватизации силилирующими агентами. Этот способ хорошо зарекомендовал себя в токсикологической практике, но может являться неприемлемым для ряда аналитиков вследствие некоторых затруднений, возникающих при совместном анализе недериватизированных и триметилсилилированных образцов на одной ГХ-МС системе.
Целью данной работы является разработка сравнительно недорогого способа установления факта приема JWH-018 и JWH-073, включающего кислотную деконъюгацию образцов мочи и последующее обнаружение дезалкилированных метаболитов в виде метильных дериватов методом ГХ-МС. Для этого метаболиты были идентифицированы методами ГХ-МС и ЖХ-МС/МС. Основным недостатком данного способа является невозможность дифференцирования вида принимаемого соединения (JWH-018, JWH-073 или иной гомолог) вследствие того, что структуры обнаруживаемых метаболитов не имеют боковых N-алкильных цепей, и, следовательно, не содержат информации об исходных соединениях. Тем не менее, факты приема обоих соединений должны фиксироваться в соответствующих лабораториях, поскольку оборот рассматриваемых каннабимиметиков в России запрещен. Согласно нашим сведениям, информация об идентификации дезалкилированных гидроксилированных метаболитов (JWH-073) приведена впервые.
Эксперимент
Реактивы. N,O-Бис(триметилсилил)трифторацетамид, содержащий 1% триметилхлорсилана (BSTFA), метилиодид и гидроксид тетраметиламмония (25 масс.% в метаноле) были куплены в Acros Organics (Гел, Бельгия). Ацетонитрил (для градиентной ВЭЖХ) был поставлен Panreac Quimica S.A. (Барселона, Испания). Формиат аммония (аналитической чистоты) и?-глюкуронидаза (тип HP-2) получали в Sigma-Aldrich (Стейнхем, Германия).Остальные растворители и реактивы получали в Экос-1 (Москва, Россия). Полоски для иммунохроматографического обнаружения наркотических средств и их метаболитов в моче (ИХА-4-Мульти-Фактор, ИХАМарихуана-Фактор and ИХА-ТАД-Фактор) покупали в ООО Фактор-Мед (Москва, Россия).
Образцы мочи. Семь образцов мочи были собраны у персон, доставленных в наркологический диспансер в состоянии наркотического одурманивания. В результате анализа, проведенного методом ГХ-МС [16, 17], в трех из этих образцов были выявлены гидроксилированные метаболиты JWH-018, и в четырех – JWH-073. Проведенные далее иммунохроматографический и обзорный ГХ-МС анализы образцов (при использовании собственной поисковой библиотеки и базы NIST, США) не выявили каких-либо иных наркотических средств (включая опиаты, тетрагидроканнабинол, амфетамины, кокаин, бензодиазепины и пр).
Пробоподготовка. Деконъюгацию метаболитов фазы II выполняли кислотным и ферментативным методами. При кислотном деконъюгировании к 2.5 мл мочи добавляли 0.25 мл соляной кислоты (конц.) и нагревали в течение 60 мин при температуре 90–95°C. Затем охлаждали и подстраивали pH образцов водным раствором аммиака (конц.) до 9-10. Смесь экстрагировали хлороформом (3 мл), центрифугировали и отделенную органическую фазу упаривали досуха в токе азота при температуре не выше 45°C. При ферментативном деконъюгировании к 2.5 мл мочи добавляли 50 мкл ?-глюкуронидазы и 1 мл фосфатного буфера (0.8 M, pH 5.5). Смесь инкубировали при 37°C в течение 24 ч. Последующие стадии были теми же, что и при кислотном деконъюгировании. Сухой остаток растворяли в 100 мкл фазы А (для ЖХ-МС/МС) или (для ГХ-МС) дериватизировали триметилсилилированием или метилированием.
Триметилсилильные (ТМС) дериваты получали в 50 мкл смеси этилацетата и BSTFA (1:1 по объему) при 50 °C в течение 30 мин. Для метилирования (Ме) остаток растворяли в смеси сухого диметилсульфоксида (100 мкл) и гидроксида тетраметиламмония (5 мкл) при непрерывном перемешивании в течение 2 мин, после чего добавляли 20 мкл метилиодида и снова перемешивали 10 мин. Затем добавляли водный раствор аммиака (0.1 M, 2 мл) и экстрагировали этилацетатом (3 мл). Отделенную органическую фазу промывали 2 мл раствора аммиака такой же концентрации и упаривали досуха. Остаток растворяли в 50 мкл этилацетата и вводили в хроматограф.
Обогащение дезалкилированных метаболитов. Обогащение метаболитов выполняли для получения чистых масс-спектров. 30 мл образца мочи, содержащего наибольшее количество метаболитов JWH-073, гидролизовали согласно методике, описанной выше, и экстрагировали 30 мл хлороформа. После упаривания органической фазы, полученный сухой остаток растворяли в элюенте (0.15 мл) и разделяли методом ВЭЖХ, используя хроматограф Agilent 1200, оборудованный бинарным насосом, диодно-матричным детектором и колонкой Zorbax Eclipse XDBC18, 4.6?150 мм). Элюирование проводили в изократическом режиме смесью воды и ацетонитрила (3:7 по объему) при скорости потока 1 мл/мин со стадией промывки (ацетонитрил, 1 мин, через 8.5 мин после ввода 30 мкл раствора образца). В этих условиях удерживание урацила (применяемого для оценки величины мертвого объема системы) и JWH-073 составляло 1.25 и 9.59 мин, соответственно. Отбирали 8 фракций (мин): 1 (1.2-1.5), 2 (1.5-1.8), 3 (1.8-2.2), 4 (2.2-4.2), 5 (4.2-6.2), 6 (6.2-8.2), 7 (8.2-10.2), 8 (10.2-12.0). Каждую фракцию упаривали до трети ее начального объема на вакуумном концентраторе (Concentrator 5301, Eppendorf AG, Гамбург, Германия), добавляли воду (1:1 по объему) и экстрагировали этилацетатом (1:1 по объему). Экстракты упаривали и дериватизировали для последующего анализа методом ГХМС. Дезалкилированные метаболиты обнаружили во фракции 3.
ГХ-МС. Для обнаружения и идентификации метаболитов использовали газовые хроматографы 6890, соединенные с моноквадрупольными массспектрометрами 5975VL (Agilent Technologies, Санта-Клара, США). Разделение выполняли с помощью колонок: слабополярной HP-5ms (30 м ? 0.25 мм ? 0.25 мкм) и среднеполярной DB-5ms (15 м ? 0.25 мм ? 0.25 мкм), работающих в трех градиентных режимах. Все три программы имели одинаковые начальные стадии: 50°C (0.5 мин), 99°C/мин (100°C, 1 мин) и отличались вдвухпоследующих (Табл. 1).
Таблица 1. Завершающие стадии температурных программ двух колонок для трех режимов
Температуры инжектора и интерфейса составляли 270 °C и 290 oC, соответственно. Пробы (0.2 мкл) вводили без сброса (splitless), газ-носитель гелий (1 мл/мин). Масс-спектры регистрировали при ионизации электронным ударом (70 эВ), температуры источника ионови квадруполябыли 230°C и 150°C, соответственно.
ЖХ-МС/МС. Жидкостные хромато-масс-спектрометрические измерения выполняли с помощью микропотокового хроматографа 1200 с колонкой Zorbax Eclipse XDB-C18 (2.1?150 мм, 3.5 мкм, 40°C), связанного с тандемным (трехквадрупольным) масс-спектрометром 6460 (Agilent Technologies). Разделения проводили в градиентном режиме с подвижными фазами A (формиат аммония, pH 5, 20 мМ) и B (ацетонитрил) по следующей программе: 40 об.% фазы B (1 мин); линейный градиент до 90 об.% фазы B (15 мин) с сохранением состава в течение 4 мин. Скорость потока 0.25 мл/мин, объем вводимой пробы 5 мкл. Масс-спектры регистрировали в режиме положительной электрораспылительной ионизации; осушающий газ азот, 300°C (7 л/мин). Напряжения на капилляре, наконечнике и фрагменторе составляли 3500, 500 и 80 В, соответственно; энергия коллизий 20 В.
Обсуждение результатов
На рис. 1 представлены структурные формулы рассматриваемых каннабимиметиков и их метаболитов. Основные направления метаболизма JWH-018 и JWH-073 рассмотрены в [14-17, 23, 27, 28](рис.1). В большинстве случаев наибольшим содержанием характеризуются моногидроксилированные формы (М6), у которых гидроксильные группы расположены на (?-1)-ых углеродных атомах боковых N-алкильных цепей. Для обнаружения этих форм наиболее удобным способом дериватизации является триметилсилилирование [14, 16-21].
Дезалкилированные гидроксилированные метаболиты (М1-М4) были первоначально обнаружены в мочевых образцах в существенных концентрациях для случая JWH-018 [14, 16, 17]. В их структурах гидроксильные группы могут находиться в разных положениях индольного и нафталинового остатков.
Рис. 1. Основные метаболиты JWH-018 и JWH-073 и их аналитические формы (ГХ-МС)
Согласно нашим измерениям, дигидродиольный метаболит М5 (по-видимому, образующийся в результате эпоксидирования и последующего гидролиза нафталинового остатка [31]) может быть обнаружен только после проведения ферментативной деконъюгации мочевых образцов глюкуронидазами. Кроме того, кислотный гидролиз М5 приводит к дегидратации, в результате которой также образуются формы М3 иМ4. Поскольку в настоящее время неизвестно, являются ли соединения М3 иМ4 продуктами ферментативного гидролиза М5 in vivo, или они элиминируют воду в результате спонтанных неферментативных процессов, то эти соединения могут считаться как метаболитами, так и артефактными формами, или же их смесью. Для упрощения, соединения М3 иМ4 в дальнейшем изложении будут называться метаболитами.
Рис. 2. Ионные хроматограммы (ЖХ-МС/МС) экстрактов дезалкилированных метаболитов JWH-073 (А-В), ферментативное деконъюгирование. Масс-спектры ионов-продуктови фрагментация протонированных структур дезалкилированных метаболитов (Г-Е)
Гомологичность структур JWH-073 и JWH-018 позволяет предположить, что их метаболические профили будут включать сходные наборы дезалкилированных метаболитов. Действительно, все дезалкилированные формы, приведенные на рис. 1, были обнаружены методом ЖХ-МС/МС с ферментативной деконъюгированием при анализе мочевых образцов, положительных как по JWH-018, так и по JWH-073, рис. 2.
Фрагментация протонированных молекул метаболитов М1-М5 заключается в разрыве связей между карбонильной группой и ароматическими остатками, а также (для М5) в дегидратации дигидродиольного производного. Как следует из рис. 2А-В, наблюдаемое содержание метаболитов М3 иМ4 несколько меньше, чем М1, М2 и М5.
Рис. 3. Ионные хроматограммы экстрактов (режим SIM, ГХ-МС) метилированных метаболитов М1-М4 в мочевых образцах, положительных по JWH073 (А) и JWH-018 (Б). Кислотное деконъюгирование, колонка HP-5ms, режим .
Обнаружение метилатов М1-М4 (ГХ-МС). На рис. 3 приведены ГХ-МС хроматограммы метаболитов М1-М4, найденные в мочевых образцах положительных по JWH-073 и JWH-018, после проведения кислотного деконъюгирования и метилирования. Спектры этих соединений приведены на рис. 4.
Фрагментация метилатов М1-М4 в условиях ионизации электронным ударом (ГХ-МС) подобна их фрагментации при электрораспылительной ионизации и последующей коллизионно-индуцированной диссоциации (ЖХ-МС/МС). Основной особенностью спектров можно считать наличие интенсивных ионов с m/z 158 и 188, соответствующих неизмененному и гидроксилированному индольному остатку. Изменение условий элюирования (табл. 1 и 2) не приводило к обнаружению новых соединенийс молекулярной массой 315.
Рис. 4. Масс-спектры метилированных метаболитов М1-М4 (ГХ-МС)
Таблица 2. Линейные индексы удерживания метилатов дезалкилированных моногидроксилированных метаболитов
Надежность обнаружения метаболитов определяется, в частности, их концентрацией в образцах мочи, которая зависит от времени отбора образца после курения, вводимой дозы и индивидуальных физиологических особенностей организма курильщика. В табл. 3 приведены площади пиков дезалкилированных метаболитов относительно моногидроксилированных метаболитов JWH-018 и JWH073 во всех рассмотренных образцах. Несмотря на то, что в случае JWH-018 отмечается некоторое снижение чувствительности (в 3-5 раз), мы полагаем, что обнаружение дезалкилированных метаболитов приемлемо для определения факта употребления JWH-018 и JWH-073.
Таблица 3. Площади пиков дериватизированных метаболитов (% от наибольшего). Режим измерения SIM при регистрации ионов, m/z 158, 188, 315 (М1-М4, метилирование); 270, 285, 429 (М6, JWH-018, ТМС) и 270, 285, 415 (М6, JWH-073, ТМС)
Заключение
Методами ГХ-МС и ЖХ-МС/МС показана идентичность четырех дезалкилированных моногидроксилированных мочевых метаболитов JWH-018 и JWH-073 и приведены их хромато-масс-спектрометрические характеристики. Предложен экономичный способ определения факта употребления JWH-018 и JWH073 без возможности их дифференциации. Способ основан на обнаружении дезалкилированных метаболитов в моче курильщиков методом ГХ-МС после подготовки проб, включающей кислотное деконъюгирование и синтез метильных дериватов. В этом способе по сравнению со способом определения триметилсилильных дериватов имеет место некоторое падение чувствительности, однако его достоинством является отсутствие необходимости применения силилирующих дериватизирующих агентов, вызывающих модифицирование неподвижных фаз.
